MALDI BIOTYPER

MALDI Biotyper – программно-аппаратный комплекс, предназначенный для быстрой идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-ToF масс-спектрометров серии FLEX производства Bruker (например, Microflex, Autoflex ).
Метод выявляет уникальный набор белков исследуемых микроорганизмов – своеобразный «отпечаток пальца». Идентификация микроорганизма происходит в основном по консервативным рибосомальным белкам, которые встречаются во всех микроорганизмах.
Биоинформационная модель, основанная на анализе белков, позволяет надёжно и точно проводить идентификацию конкретного микроорганизма до вида путём сопоставления получаемых масс-спектров белков с обширной базой данных. На конец 2019 года база Biotyper составляет более 2900+ видов микроорганизмов.

Как следует из названия, масс-спектрометр — прибор, измеряющий массу вещества. Проще говоря, масс-спектрометр— это очень точные и чувствительные весы, способные «взвешивать» различные молекулы, в частности, пептиды, белки, нуклеиновые и жирные кислоты.
Для того, чтобы провести масс-спектрометрический анализ («взвешивание»), необходимо получить ионы (заряженные частицы) исследуемого вещества. MALDI - (МАЛДИ, матрично активированная лазерная десорбция и ионизация) – один из способов такой ионизации вещества. Он наилучшим образом подходит для исследования крупных био-полимеров, таких как белки.
Ниже приведено формальное определение: Масс-спектрометрия (MS) — метод исследования массы (или соотношения массы к заряду [m/z]) вещества посредством специальных воздействий электрических и магнитных полей на исследуемое вещество в ионизированной форме.

Понятие масс-спектрометрии включает в себя достаточно большую группу приборов, основанных на различных принципах ионизации и разделения ионов вещества в полях, необходимых для получения масс-спектра.
Поскольку белки, пептиды, нуклеиновые кислоты являются тяжелыми полимерами со сложной структурой, то существуют определенные требования к ионизации и разделению биомолекул в полях:

–Сохранение целостности молекул при ионизации

–Эффективное разделение ионов биомолекул в полях

–Ионизация должна носить предсказуемый характер

–Простая пробоподготовка

–Простая интерпретация данных

Из множества вариантов получения и разделения ионов MALDI-ToF масс-спектрометры наилучшими образом отвечают заявленным характеристикам.
Для указания типа используемого метода в названии прибора приводится своеобразная классификация масс-спектрометрии, указывающая на метод ионизации и метод разделения ионов.
Таким образом, MALDI-ToF подразумевает собой прибор, где и используется:

• MALDI или МАЛДИ - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация – система получения ионов из твердой фазы. Это метод «мягкой» ионизации сухого вещества, обусловленный воздействием лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом.
• ToF – время-пролетный метод разделения ионов в вакууме (измерение скорости дрейфа частиц в специальной трубе)

Действительно, наиболее доступная модификация MALDI масс-спектрометра Bruker Microflex LT/SH примерно в три раза дороже автоматического бактериологического анализатора. Однако детальный экономический анализ системы MALDI Biotyper демонстрирует более высокую рентабельность метода в сравнении с бак.анализаторами.
Даже если рассматривать исключительно экономическую составляющую метода, очевидно, что MALDI Biotyper имеет преимущество перед бак. анализатором. Выгода от использования MALDI Biotyper становится наиболее очевидной при наличии лабораторного потока от 300-500 анализов в неделю. Ключевым фактором является стоимость реагентов для масс-спектрометрической идентификации МО, которые в 50-100 раз (!) дешевле по сравнению наборами для бактериологических анализаторов. Таким образом, с каждым последующим анализом экономическая выгода становится все более очевидной. Окупаемость анализатора Microflex LT при потоке около 500 анализов в неделю составляет один год. Это позволяет в дальнейшем значительно сэкономить на реагентах в последующие периоды.
Но, безусловно, методические выгоды от использования MALDI Biotyper превосходят экономические. Производительность лаборатории при использовании метода значительно возрастает. Появляется возможность увеличения пиковой нагрузки лаборатории до 1500 идентификаций в день (прибор затрачивает менее 30 минут на идентификацию 95 образцов МО).
MALDI Biotyper изменяет саму культуру работы в бактериологической лаборатории. Исследователю становится доступно использование уже первичного посева для идентификации МО, без необходимости дополнительно пересева и ожидания лишних суток роста. Прямая идентификация положительных гемокультур позволяет на сутки раньше начать лечение больных с сепсисом. Дополнительные базы по мицелиальным грибам и микобактериям позволяют точно идентифицировать традиционно сложные для анализа микроорганизмы. Лаборанту становится доступна возможность анализа смесей из двух разнородовых культур
Безусловным достоинством метода является высокая точность самой идентификации, сравнимая с секвенированием последовательности 16S рРНК.
Ниже приводим обобщенные сравнительные характеристики работы с бак.анализатором и MALDI Biotyper

Низкая себестоимость анализа достигается путем простого протокола пробоподготовки.
Метод предусматривает нанесение материала из единичной колонии микроорганизма. Из реактивов для анализа используются только раствор «матрицы» для масс-спектрометрии (раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты или HCCA).
Для одного анализа потребуется 1 мкл матричного раствора в концентрации 10 мг НССА/мл. Таким образом, фирменной упаковки НССА, содержащей 1 грамм вещества хватит на 100 тысяч анализов. Это соответствует стоимости около одного рубля (!) на образец, с учетом стоимости растворителя.
Для увеличения достоверности анализа системы Biotyper используется «калибровочный бактериальный стандарт». Стандарт представляет собой смесь белков E.coli DH5α, с добавлением двух белков крупной массы. Калибровка происходит в рабочем диапазоне масс. Стандарт необходимо вносить в одну из точек на мишени, что соответствует доли в 4 рублей от стоимости единичного анализа.
Таким образом, стоимость реагентов для прямой MALDI идентификации составляет около 5 рублей (!) за одну идентификацию.
Остальная стоимость анализа складывается из простого лабораторного пластика, такого как одноразовые петли и типсы для дозаторов.

Еще раз отметим, что в масс-спектрометрах Bruker используется МНОГОРАЗОВАЯ стальная мишень (чип), которая НЕ ЯВЛЯЕТСЯ расходным материалом.
Не секрет, что существуют близкие приборы, использующие одноразовые стеклянные подложки в качестве MALDI мишеней. Такой подход значительно увеличивает себестоимость анализа, не улучшая его достоверности или качества.

Одним из ключевых преимуществ системы MALDI Biotyper является небольшое количество и дешевизна расходных материалов, необходимых в повседневной рутинной практике.
Для прямой идентификации используется:

• Одноразовая пластиковая бактериологическая петля объемом 1 мкл для забора колонии с чашки и нанесения ее на стальную мишень (чип).
• Заранее приготовленный раствор матрицы, наносимый в объеме 1 мкл с использованием дозатора и соответствующего наконечника.
• И калибровочный стандарт, представляющий собой белки E.Coli, наносимый также в объеме 1 мкл на одну из позиций мишени (чипа).

Дополнительные расходные материалы для MALDI Biotyper необходимы в двух основных случаях:

• Приготовление раствора матрицы и калибровочного стандарта
• Проведение процедуры дополнительной экстракции белков микроорганизмов для повышения точности идентификации

Как и все современные инновационные методы, масс-спектрометрия сперва может вызывать непонимание и опасение из-за непривычности подхода. В действительности, у рядового пользователя MALDI Biotyper не возникает необходимости погружаться в тонкости принципа действия или физических основ функционирования прибора. MALDI Biotyper управляется с помощью программы с интуитивно понятным интерфейсом на персональном компьютере под управлением привычной ОС Windows.
Как показывает многократный опыт обучения пользователей ранее не знакомых с масс-спектрометрией, система осваивается любым лаборантом за 1-2 дня.

На конец 2019 года размер базы Biotyper составляет более 2900+ видов микроорганизмов. Стоит отметить, что Bruker активно пополняет базу Biotyper. Так, еще 5 лет назад база имела записи о 1300 МО, а в начале 2012 в базе было 700 видов МО. Кроме того, дополнительно доступны базы по туберкулезным и нетуберкулезными микобактериям (более 170 видов), а также мицелиальным и дрожжевым грибам (180 видов)